Modulare Polymerplattform als neuartiger Ansatz für die Therapie von Kopf-Hals-Krebs

Abstrakt

Kopf- und Halskrebs ist die sechsthäufigste Krebsart der Welt, mit jährlich mehr als 300.000 Todesfällen, die auf die Krankheit zurückgeführt werden. Eine aggressive chirurgische Resektion, oft mit adjuvanter Radiochemotherapie, ist der Eckpfeiler der Behandlung. Die notwendige Radiochemotherapie kann jedoch zu Kollateralschäden an angrenzenden lebenswichtigen Strukturen führen und die Lebensqualität erheblich beeinträchtigen. Hier stellen wir ein neuartiges Polymer aus Poly(milchsäure-co-glycolsäure) und Polyvinylalkohol vor, das als vielseitige Multidrug-Delivery-Plattform sowie zum Nachweis auf Querschnittsbildgebung dienen kann und gleichzeitig als vertrauenswürdiger Marker für postoperative Strahlentherapie und Strahlentherapie fungiert Dosierung. In einem Maus-Xenograft-Modell Das zweischichtige Polymer aus Calciumcarbonat/Thymochinon wurde sowohl zur Polymerlokalisierung als auch zur Schmalfeldinfusion einer natürlichen therapeutischen Verbindung verwendet. Ein ähnlicher Ansatz kann bei der Behandlung von Kopf-Hals-Krebspatienten angewendet werden, wo Immuntherapie und herkömmliche Chemotherapie gleichzeitig mit unabhängiger Freisetzungskinetik verabreicht werden können.

Einführung

Klinische Begründung

Kopf-Hals-Krebs ist die sechsthäufigste Krebsart der Welt, mit mehr als 70.000 diagnostizierten Fällen in den Vereinigten Staaten pro Jahr 1 . In den letzten 30 Jahren blieb die 3- bis 5-Jahres-Überlebensrate von Patienten mit fortgeschrittenem/lokal rezidivierendem Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom (HNSCC) gering (20–30 %) 2 trotz erheblicher Fortschritte bei chirurgischen Techniken und Bestrahlung , chemotherapeutische Strategien sowie diese Behandlungen, die in Kombination verwendet werden. Ungefähr 50 % der Patienten überleben ihre Krankheit nicht und versagen bei der primären Behandlung; Daher bleibt die Rettung des Patienten mit wiederkehrendem Krebs von größter Bedeutung 3. Obwohl häufig eine palliative Chemotherapie versucht wird, verhindern die systemische Toxizität und ihre Auswirkungen auf die Lebensqualität ihre breitere klinische Anwendung 4 . Behandlungen, die eine reduzierte Dosisabgabe und Exposition gegenüber gesundem Gewebe ermöglichen und gleichzeitig eine gleichwertige Tumorkontrolle im Vergleich zu herkömmlichen Therapien bieten, würden das Überleben des Patienten und den Überlebensprozess erheblich verbessern.

Verwendung eines mehrschichtigen Polymers zur Arzneimittelabgabe

Eine tödliche Strahlungsdosis an einen Tumor abzugeben und dabei normales Gewebe in der Nähe zu schonen, bleibt eine große Herausforderung in der Strahlentherapie. Interstitielle Brachytherapie, die die chirurgische Implantation von Strahlungsquellen (Afterload-Katheter oder Seeds) in und um einen Tumor beinhaltet, gefolgt von der Abgabe einer kontinuierlichen niedrig dosierten Bestrahlung mit einem begrenzten Behandlungsvolumen, wurde verwendet 5 , 6 ,7 . Die zum Zeitpunkt der Operation platzierten Strahlungskeime, wie 125 I oder 103 Pd, setzen das Personal der Strahlung aus und es muss ein angemessener Schutz verwendet werden 8. Solche Behandlungen können auch erfordern, dass der Patient während der laufenden Therapie isoliert wird. Darüber hinaus können sich die Katheter oder Seeds aus ihrer ursprünglichen Position bewegen und so die dem Tumorbett und dem normalen umgebenden Gewebe verabreichte Strahlendosis beeinflussen 9. Einige Vorteile eines implantierten Polymersystems umfassen eine bessere Kontrolle der Dosisverteilung, die Eliminierung von Strahlenschutz und Sicherheitsproblemen für den Patienten sowie die Familie des Patienten und das behandelnde Personal. Ein wichtiger psychologischer Faktor ist, dass die täglichen Aktivitäten des Patienten während der gesamten Behandlungsdauer nicht eingeschränkt werden. Ein weiterer Vorteil dieses Polymersystems ist die Prophylaxe gegen Tumorrezidive nach Resektion. Lebensfähige Plattenepithelkarzinomzellen wurden zuvor aus der Operationswunde nach einer Halsdissektion gewonnen und es wurde gezeigt, dass sie in der Lage sind, in vitro als Kolonien zu wachsen; theoretisch können diese sich einnisten und ein Wiederauftreten des Krebses verursachen 10 .

Der kombinierte Einsatz von Strahlentherapie und Chemotherapie hat sich bei der Verbesserung des therapeutischen Index der Strahlentherapie für eine Vielzahl von Krebsarten beim Menschen als wirksam erwiesen 11,12 . Frühere Studien haben berichtet, dass die intratumorale Verabreichung von chemotherapeutischen Mitteln, wie Cisplatin, in einem Arzneimittelabgabesystem mit verzögerter Freisetzung die Antitumorwirksamkeit deutlich verbessert und die systemische Toxizität im Vergleich zu systemisch verabreichten Arzneimitteln verringert 13 . Tatsächlich haben wir bereits in unserer früheren Arbeit gezeigt, dass ein mit Cisplatin beladener Poly(e-caprolacton):Poly(lactid-cocaprolacton)-Polymerfilm zur Abgabe einer gezielten lokalen Chemotherapie in einem teilweise resezierten Xenotransplantat-Tiermodell von Kopf-Hals-Krebs verwendet werden kann 14 .

Wahl zwischen Calciumcarbonat und TQ

In dieser Studie haben wir den kombinatorischen Ansatz eines zweischichtigen Polymers unter Verwendung von CaCO 3 verwendetzur bildgestützten Erleichterung der Strahlentherapie (RT) und Thymochinon (TQ), ein Strahlensensibilisator, zur Verstärkung der RT. Calciumcarbonat ist ein inertes Material, das bei der Querschnittsbildgebung leicht nachgewiesen werden kann. Darüber hinaus ist es im Vergleich zu anderen High-Z-Metallen wie Goldnanopartikeln billiger und industriell machbar. Während der Operation können Chirurgen leicht feststellen, in welchen anatomischen Bereichen ein Tumor anhaftete oder leicht entfernt werden konnte. Intraoperativ kann der Chirurg das Polymer in den Bereichen des eng anhaftenden Tumors platzieren und so die Felder des Strahlentherapeuten präziser lenken. Patienten können dann eine Präzisionsbehandlung durch bildgeführte Lokalisierung des Polymerimplantats erhalten, wodurch Nebenwirkungen der Strahlentherapie minimiert werden. Thymochinon (TQ), ein aus Schwarzkümmelöl gewonnenes Naturprodukt,15 , 16 , 17 , 18 . Wir stellten fest, dass in einem teilweise resezierten Xenotransplantat-Tiermodell des Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinoms die zweischichtige CaCO 3 /TQ-Polymerplattform eine signifikante Verringerung des Tumorvolumens zeigte und einen Weg für die präzise Lokalisierung von Bereichen im Wundbett für Zusatz RT.

Ergebnisse

Zellen vs. TQ und Strahlung

Zur Bestimmung der optimalen TQ-Dosis, die zur Induktion von LD50 erforderlich ist, wurde ein Dosiseskalationsexperiment mit einem Panel aus einer Maus und sechs menschlichen Kopf-Hals-Zelllinien durchgeführt: SCCVIISF, FADU, SCC47, A253, Detroit 563, SCC25 und zwei Plattenepithel-Lunge Krebszelllinien RH2 bzw. A549. Über alle Zelllinien hinweg erzielte eine Dosis von 15 μmol TQ eine statistisch signifikante ( S < 0,001) LD50 oder besser, wie über eine Zellkoloniebildung (klonogener Assay) beobachtet (Abb. 1A). Daher strebten wir an, eine Dosis von mindestens 15 μM als wirksame Dosis in der Polymerschicht zur Arzneimittelabgabe für den In-vitro-Zellassay zu erreichen. Um die Gesamtdosis zu berechnen, wurden die Polymere vor der Implantation (nach chirurgischem Debulking) und erneut 30 Tage später bei Beendigung des Experiments (nach Entfernung) gewogen. Die Gewichtsänderung spiegelte die absolute Diffusion von TQ aus dem Polymerfilm wider. Dadurch wurde geschätzt, dass die über einen Zeitraum von 30 Tagen abgegebene Gesamtdosis 23 mg bei einer durchschnittlichen Dosisabgaberate von 0,77 mg pro Tag oder 4,68 μmol/μM 3 betrug. Die Mauszelllinie wurde mit 10 μmol TQ behandelt und mit 2, 4, 6 und 8 Gy bestrahlt, um zu zeigen, dass TQ plus Bestrahlung eine größere zelltötende Wirkung gegenüber Bestrahlung allein hatte (Abb. 1B). Die überlebende Fraktion bei 8 Gy war signifikant mit p  < 0,05 und mit 4,86 ​​% (SD 2,7 %) für RT allein und 1,2 % (SD 0,6 %) für RT in Kombination mit 10 μmol TQ.

Abbildung 1
Abbildung 1

Die TQ-Behandlung verringert das Überleben der Krebszellen. ( A ) Dosiseskalationsstudien unter Verwendung eines Panels menschlicher Kopf- und Nackenzelllinien und einer von der SCCVIISF-Maus abgeleiteten Linie zeigen, dass 15 μM TQ ausreichen, um die Koloniebildung um 50 % oder mehr zu reduzieren ( P  < 0,001). ( B ) Lineare quadratische Überlebenskurve, die TQ-behandeltes SCCVIISF vs. Kontrolle darstellt. TQ wirkt synergetisch mit Bestrahlung, was zu einer signifikanten Abnahme des Überlebens von Krebszellen bei 8 Gy mit p  < 0,05 und mit 4,86 ​​% (SD 2,7 %) für RT allein und 1,2 % (SD 0,6 %) für RT in Kombination mit 10 μM TQ führt.

Polymereigenschaften

Die Beurteilung des Polymerfilms mittels Rasterelektronenmikroskopie (Abb. 2 und 3) (SEM)-Bild von CaCO 3 – Mikron-Partikeln in Abb. 2A zeigt eine einheitliche Morphologie mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von ungefähr 20 μm. Wie in Fig. 2B, C gezeigt, waren In-situ-CaCO- Partikel von 3 Mikron gleichmäßig in der Polyvinylalkohol(PVA)-Folie verteilt. Das SEM-Bild in Fig. 3A zeigt die Querschnittstopographie des mehrschichtigen Polymerfilms. Der Film zeigt eine zweischichtige Struktur mit einer lateralen Größe von 120 &mgr;m und 30 &mgr;m für die CaCO 3 /PVA-Schicht bzw. die TQ/PLGA-Schicht. SEM-Bilder der CaCO 3 /PVA-Schicht und der TQ/PLGA-Schicht mit glatter Oberflächenmorphologie sind in Abb. 3B, C dargestellt. Abb. 4 zeigt, dass die Konzentration von CaCO 3kann leicht unter Verwendung eines Computertomographie-(CT)-Scans mit einem gleichen Effekt bei 1,0 Gew.-% sichtbar gemacht werden.

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Figur 2
Figur 2

Charakterisierung von CaCO 3 Mikrometer Partikeln und CaCO 3 /PVA Filmen und Freisetzungskinetik. ( A ) SEM-Bild von CaCO 3 – Mikron-Partikeln (Maßstabsbalken: 50 μm). ( B ) Mikroskopisches Bild eines CaCO 3 /PVA-Films (Maßstabsbalken: 50 &mgr;m). ( C ) CaCO 3 /PVA-Filme mit variierenden Konzentrationen von CaCO 3 (0, 0,2, 0,5, 1,0 und 2,0 Gew.-%). ( D ) Wirkstofffreisetzungseigenschaften, gemessen in vitro (schwarze Linie), während der rote Punkt die Wirkstofffreisetzung nach der Entnahme aus der terminalen Mausoperation darstellt.

Figur 3
Figur 3

Charakterisierungen von mehrschichtigen Polymerfolien. ( A ) SEM-Bild des Querschnitts des mehrschichtigen Polymerfilms (Maßstabsbalken: 50 & mgr; m). ( B ) und ( C ) SEM-Bilder der Oberfläche der CaCO 3 /PVA-Schicht und der TQ/PLGA-Schicht aus mehrschichtiger Polymerfolie (Maßstabsbalken: 5 μm). (Zweischichtige Polymermischung mit mit TQ beladener Behandlungsschicht und aus CaCO 3 zusammengesetzter Bildaufzeichnungsschicht ). In ( D ) ist die mechanische Leistung des Mehrschicht-Polymerfilms als Zugspannung vs. Zugspannung dargestellt. Die Zugfestigkeit des mehrschichtigen Polymerfilms wurde unter Verwendung dynamisch  – mechanischer  Analyse gemessen; Die Folie hat eine sehr hohe Zugfestigkeit (32,9 MPa), was für klinische Anwendungen nützlich ist.

Figur 4
Figur 4

CT-Bildgebung, die die Polymerlokalisierung im Tumorbett für die präzise Strahlentherapielokalisierung zeigt.

Sichtprüfung

Am Ende des Experiments (30 Tage nach der Polymerimplantation) wurde eine Nekropsie sowohl für die Behandlungspolymergruppe als auch für die Kontrollpolymergruppe durchgeführt, und die Gewebe wurden grob, radiografisch und histologisch untersucht ( 5 und 6 ). Vehikelkontrolltumoren (Polymere ohne Arzneimittel und ohne RT) zeigten eine Persistenz von schlecht differenzierten Karzinomen mit vollständig lebensfähigen Tumoren, wenn sie mikroskopisch bei 40 × mit H&E-Färbung bewertet wurden. Schlecht differenzierte Krebsarten erscheinen sehr anormal und es fehlen die Organisationsstrukturen der Gewebe, in denen sie sich befinden (Abb. 6). Mit TQ-Polymer behandelte Gruppen zeigten eine Tumorabtötung mit Tumornekrose entlang der Polymerschicht der Arzneimittelbehandlung ( 6 ).

Abbildung 5
Abbildung 5

Lokalisierung des Polymers durch Gross- und FDG-PET-Bildgebung. ( A1 ) Tumor exponiert mit entferntem TQ-Polymer. ( B1D1 ) zeigen transversale, koronale und sagittale Schnitte des Tumors in ( A1 ). Das FDG-PET-Signal ist um die mit TQ-eingebetteten Polymeren behandelten Bereiche ohne erneutes Tumorwachstum verringert. Pfeile markieren die Position des Polymers. Die polymere Abbildungsschicht ist in einem Standard-FDG-PET-Scan sichtbar. ( A2 ) stellt einen exponierten Tumor dar, auf den einfaches Kontrollpolymer (ohne TQ-Medikamentenschicht) aufgebracht wurde. ( B2D2 ) sind die entsprechenden PET-Bilder von ( A2 ). ( A1 ) Maustumor hatte 0,024 % ID/g FDG-PET-Aufnahme, wohingegen ( A2)hat 0,055 % ID/g.

Abbildung 6
Abbildung 6

Histologische Beurteilung des Tumors an der Stelle der Polymerentfernung. ( AD ) zeigt Tumore, die aus vier verschiedenen Mausbehandlungsgruppen gesammelt wurden: Vehikelkontrolle, TQ-eingebettetes Polymer, 3 × 4 Gy RT und 3 × 4 Gy + TQ-Polymer von links nach rechts mit ihren entsprechenden Einschüben unten. Pfeile zeigen die Position des Polymers nach der Entfernung des Tumors an. ( A ) Vehikelkontrolle: Schlecht differenziertes Karzinom mit lebensfähigem Tumor bleibt bestehen. Entlang der Polymergrenze kann eine dünne Schicht aus dunkelrosa fibrotischem und entzündlichem Gewebe beobachtet werden. ( B ) TQ-eingebettetes Polymer: Tumornekrose wird ohne lebensfähigen Tumor im Behandlungsgebiet gesehen; Die rosafarbenen Bereiche entsprechen der Nekrose, die sich unterhalb des Bereichs der Arzneimittelbehandlungsschicht erstreckt (gepunktete Linie). (C ) 3 × 4 Gy RT: Entlang der Polymerstelle wird ein schmales Nekroseband mit lebensfähigen Taschen von Tumorgewebe darunter bemerkt. ( D ) 3 × 4 Gy + TQ-Polymer: Kein lebensfähiger Tumor vorhanden.

Pathologische Untersuchung

Um pathologische Veränderungen zwischen den Behandlungsgruppen zu untersuchen, wurde eine Histologie durchgeführt, um Unterschiede auf zellulärer Ebene zu bewerten. Die Kontrollgruppe, die das Polymer ohne TQ oder Strahlentherapie erhielt, zeigte dichte Kerne an der Polymerplatzierungsstelle, was ein anhaltendes, schlecht differenziertes Karzinom mit lebensfähigem Tumor offenbarte (Abb. 6A). Die nur mit dem TQ-Polymer behandelte Gruppe (Fig. 6B) zeigte kein erneutes Tumorwachstum mit Tumornekrose und keinen lebensfähigen Tumor im Behandlungsbereich. Im Gegensatz dazu wies die Gruppe mit reiner Strahlentherapie ein schmales Nekroseband entlang der Polymerentfernungsstelle mit noch lebensfähigen Teilen des Tumorgewebes auf, die darunter zu finden waren (Abb. 6C). Die Gruppe mit TQ-Polymer und Strahlentherapie (Fig. 6D) wurde ohne vorhandenen Resttumor präsentiert.

FDG-PET/CT-Beurteilung

FDG-PET/CT-Bildgebung wurde verwendet, um die metabolische Aktivität des Tumors zu beurteilen und die Position des Polymers relativ zum Tumor zu identifizieren. Die Abbildungen 5B1–D1 demonstrieren die FDG-PET/CT-Bildgebung mit verringerter Aufnahme des PET-Tracers, die in Bereichen des Tumors beobachtet wird, die direkt mit der Kante des wirkstoffabgebenden Polymers in Kontakt stehen. Dies stand im Gegensatz zu der Kontrollpolymergruppe, die keine TQ-Medikamentenbehandlung erhielt (Abb. 5B2–D2); wo robuster Krebs fortbesteht. Die mit TQ-Polymer behandelte Aufnahme von FDG-PET war mit 0,024 % ID/g gegenüber 0,055 % ID/g jeweils halb so hoch wie die der Vehikelkontrolle.

Dynamik des Tumorwachstums

Um die Gesamtveränderungen des Tumorvolumens zu beurteilen, wurde jeder Tumor über seine Länge, Breite und Höhe mit Schieblehren gemessen. In einer Analyse der Wachstumsrate im Verlauf von 30 Tagen zeigte die Strahlentherapie plus TQ-Polymergruppen die langsamste Änderungsrate (Fig. 7A), und bei der abschließenden histologischen Untersuchung wurde kein lebensfähiger Tumor gefunden. Nach Rücksprache mit unserem Expertenteam für Kopf- und Halspathologie war diese minimale Änderung wahrscheinlich auf Schwankungen der Messzirkel aufgrund von Entzündungen und Wundheilung nach der Behandlung zurückzuführen. Beim Vergleich der Kontrollpolymergruppe mit allen anderen Behandlungsgruppen zeigte sich ein statistisch signifikanter Unterschied im Tumorvolumen (Abb. 7B, P= 0,002). Die Gruppen Strahlentherapie plus TQ-Polymer zeigten insgesamt die kleinsten Tumorvolumina. RT vs. RT + TQ-Polymerbehandlung erwies sich als signifikant mit p  < 0,05.

Abbildung 7
Abbildung 7

Abschließende Volumenmessungen. Wachstum des Tumorvolumens nach 50 % chirurgischem Debulking pro Behandlungsgruppe. N  > = 4; dreimal validiert. ( A ) Zeigt Tumormessungen, die mit Messzirkeln im Verlauf von 30 Tagen nach der chirurgischen Debulking durchgeführt wurden. ( B ) Tumorvolumen nach Resektion. * p  < 0,05, ** p  < 0,001, Fehlerbalken sind als SEM aufgetragen. TQ + fraktionierte RT spiegelt keinen physikalisch messbaren Tumor durch Caliper-Beurteilung wieder; dies wurde durch histologische Analyse bestätigt, bei der kein Restkrebs zu sehen war (Abb. 6).

Diskussion

Bedeutung dieser Studie

In dieser Studie haben wir gezeigt, dass ein modulares, zweischichtiges CaCO 3 /TQ-Polymer eine wirksame Anti-Krebs-Behandlung in In-vivo-Krebs-Xenotransplantatmodellen ermöglicht. Ein mehrschichtiges Polymer ermöglichte die individuelle Beladung und Anpassung von Medikamenten zur Krebsbehandlung. Der Polymerfilm haftet physisch an den Konturen des Tumorbetts, wenn er chirurgisch platziert wird, wodurch ermöglicht wird, dass die Arzneimittelabgabeschicht in direkten Kontakt mit den verbleibenden Krebsgeweben und/oder dem Krebsbett kommt. Die Wechselwirkung des Polymerfilms und der Tumoroberfläche zusammen mit dem langsamen biologischen Abbau des Polymers, das die lokalisierte Arzneimittelabgabe während der gesamten RT-Therapie fördert, zeigte eine signifikante Abnahme der Tumorwachstumsrate im Vergleich zu anderen Gruppen im Verlauf des Experiments.

Neuheit bei der Verwendung von TQ in Polymer

Unsere Wahl, TQ in die strahlensensibilisierende Wirkstoffschicht zu laden, wurde durch seine zuvor gezeigte Wirksamkeit gegen Krebs bestätigt 15,16 . TQ ist eine biologisch gut verträgliche Verbindung 15 , die sich auch bei unseren Mäusen zeigte, da sie an der Implantationsstelle keine lokale Gewebeverletzung zeigten. Unsere Daten zeigen auch, dass die Fähigkeit des Polymers, die verzögerte Freisetzung von TQ bereitzustellen, der Motor für den in unserer Studie beobachteten therapeutischen Nutzen ist. Es wurde gezeigt, dass TQ die Proliferation von Krebszellen hemmt; Fortschreiten des Krebszellzyklus anhalten; und induzieren pro-apoptotische Wirkungen mit den Zielen von Bcl-2, Caspasen, PPArs, NF-kB, STAT3, MAPK, Akt und ROS 16. Polymere, die therapeutische Wirkstoffe enthalten, die im Laufe der Zeit langsam freigesetzt werden können, würden selbst bei mikroskopischer Erkrankung (klinische R1-Resektion), die durch klinische Bildgebung oder Visualisierung nicht erkannt werden kann, weiterhin therapeutischen Nutzen bieten. Die Fähigkeit, die Dauer der Arzneimittelfreisetzung und die Reihenfolge der aus mehreren Schichten freigesetzten Arzneimittel zu manipulieren, kann einen großen klinischen Nutzen bei der Behandlung von Patienten hinzufügen.

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Der kombinatorische Ansatz von RT und der lokalen Freisetzung einer Chemotherapie hat sich als wirksame therapeutische Strategie erwiesen, zumal die lokale Verabreichung von Chemotherapeutika nicht zu systemischen Nebenwirkungen beiträgt 19 . Unsere Plattform macht sich dieses Prinzip zunutze und ermöglicht die synergistische Optimierung von RT durch lokale strahlensensibilisierende Arzneimittelabgabe an die Krebszellen, die nach dem chirurgischen Debulking zurückbleiben. Die Polymerplattform ermöglicht eine signifikante Reduzierung des Tumorvolumens und bietet eine Möglichkeit zur präzisen Lokalisierung von Bereichen im Wundbett für eine zusätzliche RT.

Die Verwendung mehrerer Schichten, die aus verschiedenen Eigenschaften (PVA und PLGA) zusammengesetzt sind, bietet die Möglichkeit, die Verabreichungsrate des Chemotherapeutikums und die Lebensdauer der Abbildungsschicht unabhängig voneinander zu modulieren. Der Ansatz ist ähnlich wie bei Poly (N-Isopropylacrylamid) (PNIPAAm) und PLGA für separate Freisetzungsmechanismen 20 . Die modulare Plattform ermöglicht mehrere Schichten, die eine kontrollierte und gezielte Freisetzung von Radiosensibilisatoren, zielgerichteten Inhibitoren und Immunmodulatoren ermöglichen. Frühere Studien zeigten, dass Kern-Schale-Partikel auf Magnetbasis mit verzögerter Freisetzung von Curcumin und temperaturabhängiger Freisetzung von Doxorubicin in einem orthotopen Mausmodell mit Melanomen wirksam waren 21. Mit der Änderung des Herstellungsprozesses von PVA- und PLGA-Polymeren kann die kontrollierte Freisetzung bis zu sieben Monate dauern 22 .

Verwendung von CaCO 3 zur Polymerlokalisierung

Ein neuartiges Merkmal des Studiendesigns war die Verwendung von CaCO 3 zur Visualisierung auf Querschnittsbildgebung. In früheren Studien wurden inerte Metalle oder röntgendichte Hydrogele (z. B. TraceIT Tissue Marker) als Referenzmarker für die bildgeführte Strahlentherapie, die externe Bestrahlung und die Lokalisierung der Brachytherapie verwendet 23,24 . Der Vorteil der Verwendung von CaCO 3 ist die Verwendung einer natürlichen Verbindung, die im Laufe der Zeit vom Körper absorbiert wird 25 . Dies ist die erste Studie dieser Art, die den Nutzen von eingebettetem CaCO 3 demonstriertin einem Polymer als potenzieller Bezugsmarker für die bildgeführte Strahlentherapie. Während der Operation können Chirurgen leicht feststellen, in welchen anatomischen Bereichen ein Tumor anhaftete oder leicht entfernt werden konnte. Intraoperativ kann der Chirurg das Polymer in den Bereichen des eng anhaftenden Tumors platzieren und so die Felder der Strahlentherapeuten präziser lenken. Die Flexibilität der Polymerfolie ermöglicht es ihr, sich mit dem Gewebe, auf dem sie sich befindet, zu verformen. Die Flexibilität der Polymere ist ein einzigartiges Merkmal im Vergleich zu herkömmlichen Markern, die zur Lokalisierung verwendet werden. Die Form der Polymerfolie im Patienten kann dann die konforme Strahlentherapie leiten und sekundäre Nebenwirkungen der Strahlentherapie minimieren.

Fazit

Die Behandlung von Kopf-Hals-Tumorpatienten stellt Chirurgen und Radioonkologen vor große Herausforderungen. Hier berichten wir über einen neuartigen zweischichtigen Polymerfilm, der Antitumortherapeutika mit signifikanter Tumorabtötung abgeben kann. Diese Polymerfolie wurde entwickelt, um intraoperativ auf das Operationsbett aufgebracht zu werden, nachdem der Tumor entfernt oder verkleinert wurde, wodurch eine verbesserte postoperative Strahlenbehandlung ermöglicht und auch als Plattform für die Verabreichung von Therapeutika und Immunmodulatoren fungiert. Neben ihren klinisch relevanten Merkmalen bietet die modulare Natur dieser Polymerplattform einen eleganten Ansatz für zukünftige Untersuchungen, der es uns ermöglicht, nach spezifischen molekularen Zielen zu suchen. Wir sind in der Lage, Polymere herzustellen, die spezifisch auf den Tumor jedes Patienten abzielen, da wir die Tumore profilieren und sie dann selektiv auf der Polymerplattform anvisieren können. Da immer mehr Kombinationen der Polymerplattform entwickelt werden, kann die direkte Polymertherapie eine wichtige Rolle im Waffenarsenal gegen Mund- und Kopf-Hals-Karzinome sowie viele andere Krebsarten und menschliche Krankheiten spielen.

Methoden

Zellkultur

Kopf-Hals-Krebszelllinien-Panels wurden bei der ATCC bestellt, und von der Maus stammendes Plattenepithelkarzinom, SCCVIISF, wurde spontan von einem Maustumor eingefangen und in Kultur gezüchtet. Alle Zelllinien wurden unter den folgenden Bedingungen kultiviert: 37°C, 5 % CO 2 Inkubator mit Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin. Das Medium wurde zweimal pro Woche gewechselt, bis die Zellen konfluent waren. Konfluente Zellen wurden dann passagiert oder zur Verwendung geerntet.

Synthese von Mehrschichtfilmen

Das Poly(D,L-lactid-co-glycolid) (PLGA, 50:50, Mn 25.000), Polyvinylalkohol (PVA, MW: 31.000–50.000) und Dichlormethan (DCM) wurden von Sigma-Aldrich (Santa Barbara) bezogen , VEREINIGTE STAATEN VON AMERIKA). Die phosphatgepufferte Kochsalzlösung (pH 7,4) wurde von Gibco Life Technologies (AG, Schweiz) bezogen. Alle in dieser Studie verwendeten Chemikalien waren von analytischer Reagenzqualität und wurden ohne weitere Reinigung verwendet.

Mehrschichtfolien wurden Schicht für Schicht hergestellt, und die Herstellung jeder Schicht hing von verschiedenen Faktoren des Materials ab, einschließlich unter anderem seiner Steifheit, Zähigkeit, Adhäsion, Abbaubarkeit, Porosität, Hydrophilie und Belastbarkeit. Eine Herstellungstechnik umfasste eine mechanische Schleuder, gefolgt von Erhitzen und Verdampfen des Lösungsmittels. Zunächst wurden 10 g des PVA-Pulvers zu 100 ml entionisiertem Wasser gegeben und dann 1 h bei 95 °C zentrifugiert, um eine 10 % (w/v) PVA-Lösung zu erhalten. Dann werden 0,4 g Calciumcarbonat (CaCO 3) Mikropartikel wurden nach 5-minütiger Beschallung im Bad in 10 ml einer PVA-Lösung dispergiert, und die Mischung wurde 2 min gevortext (Abb. 1). Die erhaltene homogene Lösung wurde auf eine Kunststoff-Petrischale getropft und in einen Schüttler gegeben, so dass die Lösung gleichmäßig verteilt werden konnte. Anschließend wurde die Petrischale für 2 h in einen Ofen bei 70 °C überführt, um sicherzustellen, dass das Wasser vollständig verdunstet war. Schließlich wurde die erste Schicht (CaCO3/PVA-Film) für die CT-Bildgebung erhalten. Außerdem wurden 0,5 g des PLGA-Pulvers in 10 ml DCM zugegeben und dann 30 min lang zentrifugiert, um eine 5 % (w/v) PLGA-Lösung zu erhalten. Dann wurden 20 mg der TQ-Pulver in 2 ml einer PLGA-Lösung nach 5-minütiger Beschallung im Bad dispergiert und die Mischung 2 min gevortext. Die resultierende Mischung wurde auf die erste Schicht in der Petrischale getropft und dann mit Umgebungsluft unter geeigneter Belüftung für 30 min eingedampft. Der mehrschichtige Polymerfilm wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie abgebildet (Abb. 2). Die Zugspannung wurde für das Polymer gemessen, wie in Abb. 3 gezeigt. Schließlich wurden Mehrschichtfolien mit der ersten Schicht (CaCO3 /PVA-Film) für die CT-Bildgebung und die zweite Schicht (TQ/PLGA-Film) für die Chemotherapie erhalten (Abb. 4).

Protokoll der Mauschirurgie

Männliche C3H/HeJ-Mäuse (The Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA) wurden in der Studie verwendet (Animal Research Committee (ARC), Protokollnummer 2008-147). Tierforschungsausschuss des Kanzlers der Universität von Kalifornien, Los Angeles, und Tierforschung: Berichterstattung über In-vivo-Experimente (ARRIVE) 26Richtlinien und Protokolle wurden genehmigt und befolgt. Zum Testen der Polymerplattform wurden 20 8 Wochen alten C3H/HeJ-Mäusen 400.000 Zellen einer aus der Maus stammenden Plattenepithelkarzinomlinie SCCVIISF in die rechte Hinterflanke injiziert. Das Tumorwachstum wurde dreimal pro Woche nach der Polymerimplantation für 18–31 Tage mit einem Messzirkel beurteilt, um die Antitumorwirksamkeit der verschiedenen Behandlungen zu bewerten. Die Kontrollmäuse benötigten Euthanasie, wie vom Animal Research Committee der University of California in Los Angeles und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der American Veterinary Medical Association (AVMA) für die Euthanasie von Tieren (2020) 27 aufgrund der Tumorlast festgelegt. Die Längen, Breiten und Höhen (in mm) der Tumore wurden gemessen und das Tumorvolumen (cm 3) wurde nach der Formel berechnet: Tumorvolumen  =  π/6  ×  Länge  ×  Breite  ×  Höhe . Als die Tumore eine durchschnittliche Größe von 0,5–1 cm erreichten, wurden alle Tiere operiert, um ihre Tumore um 50 % zu verkleinern. Dies wurde durchgeführt, um die chirurgische Situation anzunähern, wenn der Tumor eines Patienten nicht resezierbar ist und etwas Tumor vor der Polymertherapie zurückgelassen wird. Die Tiere wurden dann zufällig den verschiedenen Behandlungsgruppen zugeteilt. Die Behandlungsgruppen umfassten: (1) Inertes Polymer ohne Wirkstoff; (2) TQ-Polymer; (3) Inertes Polymer + 3 × 4 Gy RT; (4) TQ-Polymer + 3 × 4 Gy RT. Es wurde keine systemische TQ-Behandlung gegeben. Jedes Tumorbett wurde mit 2,25 cm 2 bedecktdes Polymers in Form des verbleibenden Tumors geschnitten. Das Polymer wurde über die Tumorränder drapiert und an Ort und Stelle vernäht.

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Strahlentherapie

Mäuse in der RT-Gruppe wurden mit Ketamin/Xylazin anästhesiert und es wurde Augensalbe an den Tagen 1, 2 und 3 nach der Operation für die RT-Behandlung auf ihre Augen aufgetragen. Die Mäuse wurden unter einer Bleiabschirmung von ½ Inch positioniert, wobei nur der Tumor freigelegt wurde. Eine Röntgendosis wurde mit 0,4299 Gy/min für 9,3 min abgegeben, bis 4 Gy der Gesamtdosis empfangen wurden. Mäuse erhielten 3 × 4 Gy RT, was der skalierten vergleichbaren Dosis entspricht, die Kopf-Hals-Krebspatienten verabreicht wird.

MicroPET-Bildgebung

Im Preclinical Imaging Technology Center des Crump Institute wurde eine In-vivo-Bildgebung bei Kleintieren durchgeführt. Den Mäusen wurde über die laterale Schwanzvene ein Radiotracer (70 μCi für 18F-FDG und 200–400 μCi für 11C-L-Glutamin) injiziert, und sie wurden dann 60 Minuten lang unter 2 % Isofluran-Anästhesie aufgenommen, gefolgt von microPET ( G8 PET/CT, PerkinElmer) und microCT (CrumpCAT, Arion Hadjioannou Labor) Bildgebung. Die Quantifizierung der 18F-FDG-Aufnahme erfolgte unter Verwendung der AMIDE-Software, indem eine interessierende Region über den Tumor und den gesamten Körper gezogen wurde, sowie durch Berechnung jedes der maximalen Aufnahmewerte (SUVmax) als Prozent der injizierten Dosis pro Gramm ( %ID/g).

Gewebeentnahme

Nachdem die Tiere getötet worden waren, wurde eine makroskopische Untersuchung des umgebenden Gewebes durchgeführt. Zwischen den Gruppen konnten keine erkennbaren Unterschiede an der Implantationsstelle beobachtet werden. Tumorproben wurden zum Schneiden gesammelt und Hämotoxin- und Eosin-Färbungen wurden durch das UCLA Translational Core Pathology Lab durchgeführt. Die histopathologische Untersuchung wurde mit Unterstützung eines erfahrenen Pathologen am UCLA Medical Center durchgeführt.

Schätzung der Abgabe der TQ-Dosisrate

Eingebettete Polymere wurden vor der Implantation und nach der Resektion gewogen. Die Abbildungs- und Arzneimittelbehandlungsschicht wurden auseinandergezogen und separat gewogen, da die Abbildungsschicht für eine Haltbarkeit von drei Monaten formuliert war, während die Arzneimittelbehandlungsschicht für eine Haltbarkeit von 1–1,5 Monaten formuliert war. Durch Subtrahieren des Gewichtsunterschieds vor und nach einem Monat Implantation stellten wir fest, dass die CaCO 3 -Bildgebungsschicht 5 % ihres Gewichts und die Arzneimittelbehandlungsschicht 60 % ihres Gewichts verloren, was einer geschätzten Abgabe von 0,77 mg pro Tag entspricht oder 4,68 μM/μM 3 .

Statistiken

Die statistische Signifikanz wurde auf P  = 0,05 festgelegt. Das Dosiseskalationsexperiment für die optimale TQ-Dosis, die erforderlich ist, um LD50 über acht Zelllinien zu induzieren, wurde über eine angepasste, nichtlineare Regressionskurve generiert und über einen t-Test bei einer Stichprobe bestimmt. Das Tumorvolumen wurde zwischen den Behandlungsgruppen mit einem Einweg-Varianzanalysemodell verglichen. Zusätzlich wurde die statistische Signifikanz von Unterschieden im Tumorvolumen beim Vergleich der Kontrollgruppe mit allen anderen Behandlungsgruppen über einen ungepaarten t-Test mit zwei Stichproben bestimmt. Eine lineare quadratische Überlebenskurve, die TQ-behandelte SCCVIISFs im Vergleich zur Kontrolle darstellt, wurde über GraphPad Prism analysiert.

Verweise

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Informationen zum Autor

Anmerkungen des Autors

  1. Diese Autoren haben zu gleichen Teilen beigetragen: Yazeed Alhiyari und Jundong Shao.

Zugehörigkeiten

  1. Abteilung für Kopf- und Halschirurgie, David Geffen School of Medicine, University of California, 10833 Le Conte Ave, 62-132 CHS, Los Angeles, CA, 9009, USA

    Yazeed Alhiyari, Albert Y. Han & Maie A. St. John

  2. Institut für Bioingenieurwesen, University of California Los Angeles, Los Angeles, CS, USA

    Jundong Shao & Zhen Gu

  3. Jonsson Comprehensive Cancer Center, Medizinisches Zentrum der Universität von Los Angeles, Los Angeles, CA, USA

    Albert Y. Han, David Shackelford und Maie A. St. John

  4. David Geffen School of Medicine, Universität von Los Angeles, Los Angeles, CA, USA

    Albert Y. Han, Amanda Miller & Marie Luff

  5. DGSOM-Abteilung für Lungen- und Intensivmedizin, Programm für Kopf- und Halskrebs, Universität von Los Angeles, Los Angeles, CA, USA

    Milica Momcilovic, David Shackelford & Maie A. St. John

  6. Abteilung für Pathologie und Labormedizin, UCLA Medical Center, Los Angeles, CA, USA

    Jeffrey F. Krane

Beiträge

YA vorgeformte/entworfene Experimente, Manuskriptschreiben und alle Abbildungen außer Polymer. JS-Polymerherstellung und -quantifizierung, hergestellte Polymerfiguren und Schreiben von Polymermethoden. AH Manuskriptverfassen und Lektorat für „klinisches Fachwissen“. AM assistierte bei Tierversuchen, Manuskript schreiben. JK Beurteilung histologischer Objektträger/ Interpretation histologischer Abbildungen. ML hilft gesammelte und eingefügte Zitate. MM Manuskript bearbeiten. DS Manuskript bearbeiten, experimentelles Feedback. ZG experimentelles Design, Polymer- und Bioengineering-Anleitung. MSJ experimentelles Design, klinische Anleitung.

Korrespondierende Autoren

Korrespondenz mit Zhen Gu oder Maie A. St. John .

Ethik-Erklärungen

Konkurrierende Interessen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Zusätzliche Information

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Alhiyari, Y., Shao, J., Han, AY et al. Modulare Polymerplattform als neuartiger Ansatz zur Therapie von Kopf-Hals-Krebs. Sci Rep . 12, 3592 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-07324-y

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